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LA RIVOLUZIONE CRISPR/CAS E LA TERAPIA GENICA

La tecnologia CRISPR/Cas ha rivoluzionato l’editing genomico grazie alla sua semplicità ed efficienza. Con la precisione garantita da un meccanismo perfettamente affinato dall’evoluzione, permette di modificare in modo mirato il DNA e quindi correggere eventuali geni difettosi, aprendo le porte allo sviluppo di nuove terapie geniche.

Lavorazione di cellule in laboratorio
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In seguito all’annuncio dei nuovi vaccini a RNA messaggero per contrastare la COVID-19, si è parlato molto spesso a sproposito di terapia genica e di effetti collaterali che avrebbero modificato il nostro DNA in modo irreparabile. Dal punto di vista scientifico, queste sono esternazioni prive di qualsiasi fondamento, ma per coloro che non hanno esperienza in questo ambito potrebbe risultare difficile capire il perché. Infatti, se i vaccini a RNA sono una novità per i non addetti ai lavori, la terapia genica è forse qualcosa di ancora meno conosciuto e, di conseguenza, trovarsi a paragonarli senza conoscere a fondo la materia può portare a grande confusione e conclusioni errate.
Fortunatamente, il funzionamento dei vaccini a RNA è stato già ampiamente spiegato con chiarezza in diverse sedi, questo grazie anche all’aiuto di una conoscenza di base dei vaccini da parte delle persone, la quale ha permesso di fare leva su concetti già acquisiti e di concentrarsi sulla componente più innovativa (l’RNA) per ottenere infine il quadro completo. Purtroppo, non si può dire altrettanto della terapia genica e dell’editing genomico in generale, ovvero quella tecnologia che ci permette di manipolare il DNA e modificare il comportamento di alcune cellule (se sono difettose, ad esempio, correggendone alcune funzioni), complice anche il fatto che la sua applicazione in campo medico riguarda un numero molto più piccolo di persone rispetto a una vaccinazione di massa. Tuttavia, grazie a risultati promettenti e anche al mondo televisivo/streaming (la serie Netflix “Selezione Innaturale” dà spunti molto interessanti), si inizia a parlarne un po’ di più e, per evitare di confondere realtà e fiction, proviamo a spiegare meglio di cosa si tratta partendo dall’ingrediente principale, ovvero il sistema CRISPR/Cas, e arrivando al suo utilizzo in ricerca e in medicina.

CRISPR/Cas nasce nei batteri come difesa contro i virus

Il nome CRISPR/Cas rappresenta le due componenti del sistema, ovvero la proteina Cas e le CRISPR, acronimo di Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats, un nome parecchio complicato che possiamo semplificare con “corte sequenze di DNA ripetute”. Infatti, al momento, più che sui tecnicismi del nome, le cose su cui è importante focalizzarsi sono tre: di quale organismo parliamo, a cosa servono queste sequenze di DNA insieme alla proteina Cas e come si è evoluto il tutto.

Partiamo dalla prima, ovvero l’organismo. Questo sistema è stato scoperto nei batteri e, in particolare, osservando il loro DNA. Il DNA è una molecola presente nelle cellule degli esseri viventi ed è una sorta di manuale di istruzioni composto da 4 lettere (A-T-C-G). La loro combinazione, ovvero la sequenza, codifica per tutte quelle informazioni che la cellula necessita per svolgere le proprie funzioni e, di conseguenza, per vivere. Quindi, sapendo che specifiche sequenze di DNA codificano per delle istruzioni e che le CRISPR sono a tutti gli effetti delle sequenze, possiamo fare il passo successivo e spiegare che tipo di informazioni sono racchiuse in esse e la loro funzione insieme alla proteina Cas.

Per spiegare in modo semplice la funzione del sistema CRISPR/Cas nei batteri, immaginate per un attimo che il batterio sia in realtà una vecchia città del Far West. Come abbiamo imparato dai film, in questo scenario ci sono tre elementi imprescindibili: lo sceriffo, le locandine dei ricercati e i ricercati stessi che minacciano la sicurezza della città. Lo sceriffo è rappresentato dalla proteina Cas, le locandine dalle sequenze CRISPR e i ricercati dai virus. Ebbene sì, anche i batteri vengono infettati dai virus, proprio come noi esseri umani. Tenendo a mente questi ruoli, il funzionamento dovrebbe a questo punto risultare abbastanza intuitivo. Le sequenze CRISPR, infatti, sono una copia delle sequenze che i virus iniettano nella cellula per riprodursi e fungono da informazione per la proteina Cas che, grazie ad esse, è in grado di riconoscere tali sequenze, legarle e distruggerle tagliandole in innocui pezzi più piccoli e impedendo al virus di replicarsi. Esattamente come uno sceriffo riconosce e arresta un ricercato grazie alla locandina che ne permette il riconoscimento.

Infine, per capire come questo sistema si sia evoluto e adattato, possiamo rimanere ancora un attimo nel Far West e completare l’analogia. Come sappiamo, infatti, la locandina di un ricercato viene fatta sulla base di informazioni acquisite durante incontri precedenti con quel determinato fuorilegge, come ad esempio l’aspetto fisico e il volto. Allo stesso modo, le sequenze CRISPR derivano proprio da infezioni virali precedenti durante le quali il batterio ha “messo da parte” alcune sequenze dei vari virus integrandole nel proprio DNA, proprio come fossero le locandine dello sceriffo. In questo modo, esso sarà protetto da una seconda infezione, perché, in quel caso, il sistema CRISPR/Cas riconoscerà le sequenze virali e le distruggerà, bloccandone la replicazione.

L’utilizzo di CRISPR/Cas come strumento di editing genomico in laboratorio

Prima dell’era CRISPR/Cas, l’editing genomico era già ampiamente usato in ricerca, sia su colture cellulari, sia su organismi modello, come ad esempio i topi. Lo scopo è quello di modificare il DNA per attivare, disattivare o modulare alcune funzioni della cellula e, non ultimo, anche di aggiungere funzioni nuove. Il DNA, infatti, codifica per quelle informazioni necessarie a produrre proteine, ovvero quelle molecole che svolgono attivamente tali funzioni. L’informazione presente sul DNA viene copiata sotto forma di RNA messaggero (mRNA), il quale a sua volta viene letto da macchinari cellulari specifici che sintetizzano la rispettiva proteina. Modificando il DNA, quindi, si va ad influire direttamente sula sintesi proteica e, di conseguenza, sulle funzioni cellulari. Le procedure utilizzate prima di CRISPR/Cas erano tuttavia molto più lente e laboriose e, in alcuni casi, anche molto più costose, limitandone quindi notevolmente l’applicazione all’interno dei vari progetti di ricerca.

L’intuizione che ha dato il via all’era del CRISPR/Cas è tanto semplice quanto geniale (come spesso accade alle intuizioni rivoluzionarie): se le sequenze CRISPR del batterio fanno da guida alla proteina Cas per tagliare il DNA virale in un punto preciso, si potrebbero sostituire le CRISPR con sequenze fatte su misura per permettere alla Cas di riconoscere e tagliare il DNA di altri organismi. Naturalmente, il processo che ha portato dall’intuizione iniziale allo sviluppo della tecnologia che oggi si usa nei laboratori è durato anni ed è stato tutt’altro che immediato, poiché trasportare un sistema proprio dei batteri all’interno di organismi diversi richiede diversi gradi di ottimizzazione e un attento controllo di ciò che si sta facendo, ma, alla fine, l’impresa è riuscita.

Grazie a questi studi, che sono valsi anche un Nobel, abbiamo oggi una tecnologia estremamente economica ed efficiente per modificare il DNA in laboratorio, la quale richiede due cose molto semplici: la presenza della proteina Cas e la sequenza di DNA che vogliamo tagliare e modificare. In termini pratici, per un laboratorio significa far esprimere tale proteina nella coltura cellulare o nell’animale di cui si vuole modificare il DNA, ovvero una procedura quasi di routine, e, infine, comprare o preparare una piccola sequenza di DNA (o RNA) che viene rilasciata poi all’interno delle cellule desiderate tramite protocolli appositi. Qui, la proteina Cas verrà guidata da tale sequenza verso il punto designato del DNA della cellula e lo taglierà, permettendo infine di apportare le modifiche desiderate. Queste modifiche sfruttano poi meccanismi ulteriori che necessiterebbero di articoli completamente dedicati, ma siccome la rivoluzione CRISPR/Cas non riguarda essi in particolare, possiamo limitarci a conoscerne l’esistenza senza andare nei dettagli.

Alcune mutazioni alla base delle malattie genetiche possono essere corrette

Alcune patologie che colpiscono gli esseri umani vengono chiamate malattie genetiche, poiché l’origine di tali malattie risiede in mutazioni presenti nel DNA. Tali mutazioni possono coinvolgere sia interi cromosomi (o parte di essi), quindi porzioni molto grandi del DNA, oppure singoli geni all’interno di specifici cromosomi che sarebbero altrimenti perfettamente normali. I geni non sono nient’altro che le istruzioni presenti nel DNA di cui abbiamo parlato all’inizio e sono quindi sequenze di DNA che devono avere alcune caratteristiche ben precise per poter garantire un corretto funzionamento. Le più importanti sicuramente sono: corretto numero di copie di ogni gene e la corretta sequenza di lettere del gene stesso. Quando queste condizioni non si verificano, ad esempio perché l’intero cromosoma è duplicato o assente, o perché il singolo gene ha una sequenza diversa dal normale, le istruzioni codificate diventano “difettose”, andando a creare problematiche di diverso tipo che possono avere conseguenze molto gravi.

Molte di queste patologie sono state studiate a fondo negli anni e oggi conosciamo bene le mutazioni alla base di alcune di esse, permettendoci di sviluppare nuove terapie mirate alla correzione di tali mutazioni. Purtroppo, quando la causa è da imputarsi a interi cromosomi, l’ostacolo è ancora troppo grande per essere oltrepassato con i mezzi che abbiamo oggi, tuttavia, tante malattie genetiche originano da piccole mutazioni su singoli geni e queste sono decisamente alla nostra portata. Due esempi molto famosi sono la distrofia muscolare di Duchenne e l’anemia falciforme, ma esistono anche condizioni più rare e meno conosciute come alcune distrofie ereditarie della retina, le quali possono portare a cecità completa. Nel caso della distrofia muscolare e della distrofia della retina dipendente da RPE65, i geni coinvolti hanno mutazioni che li rendono inattivi, causando l’assenza di proteine specifiche, mentre nell’anemia falciforme, il gene che codifica per la produzione di una parte dell’emoglobina subisce una mutazione che fa cambiare leggermente le proprietà chimiche della proteina prodotta, la quale verrà espressa normalmente, ma non sarà in grado di funzionare correttamente.

Sapendo che l’assenza di alcune proteine o la presenza di proteine difettose sono alla base dello sviluppo di queste malattie, i primi approcci di terapia genica sono stati rivolti al reinserimento di copie corrette e funzionanti dei geni in questione all’interno delle cellule dei pazienti. In questo modo, i nuovi geni permetterebbero la produzione delle proteine “corrette”, le quali andrebbero a compensare il mancato funzionamento di quelle assenti o di quelle difettose, migliorando il decorso della malattia o addirittura risolvendola completamente. Questo processo di reinserimento può avvenire sia in vivo, quindi direttamente nel paziente, oppure ex-vivo, ovvero prendendo alcune cellule dall’individuo, modificarle in laboratorio e poi reinserirle nel paziente. Il successo di entrambi i metodi, tuttavia, è fortemente dipendente da molti fattori, tra cui la facilità ed efficienza dell’inserimento di questi nuovi geni, il numero di mutazioni e l’eventuale presenza di mutazioni dominanti. Quest’ultime, infatti, non possono essere compensate dalla presenza del gene corretto, rendendo inutile la terapia. Fortunatamente, lo sviluppo della tecnologia CRISPR/Cas ci dà oggi un’arma in più per superare più facilmente tali problemi.

CRISPR/Cas e terapia genica, una nuova frontiera per la cura di malattie genetiche

Come già accennato sopra, CRISPR/Cas non è solo una tecnologia più economica, ma è anche estremamente efficiente e, soprattutto, più facile da applicare su numeri più grandi. Per fare un esempio pratico, se dovessimo modificare due geni contemporaneamente con una tecnologia dell’era pre-CRISPR/Cas chiamata TALEN, dovremmo far sintetizzare proteine diverse in grado di riconoscere e tagliare i due geni, con costi e tempistiche non di poco conto. Con CRISPR/Cas, invece, siccome la proteina Cas è sempre la stessa, basterebbe far sintetizzare due sole sequenze di DNA o RNA (a seconda del protocollo che si vuole usare) le quali sono economiche e ottenibili in 24h.

Questi vantaggi a primo impatto possono sembrare minimi, ma hanno in realtà aumentato considerevolmente la capacità dei ricercatori di studiare in laboratorio gli effetti delle varie mutazioni e rispettive correzioni su cellule e modelli animali, uno step fondamentale per poter fare il passo successivo e arrivare alle terapie geniche sugli esseri umani. Per alcune malattie genetiche conosciute da tempo, infatti, i primi tentativi di terapia genica sono già in corso o approvati con risultati molto promettenti, come ad esempio contro anemia falciforme e talassemia, distrofia muscolare di Duchenne e una forma di distrofia ereditaria della retina. Oggi, grazie a CRISPR/Cas, la ricerca ha notevolmente accelerato il passo, guidata da una maggiore facilità nell’acquisire certe conoscenze e permettendoci di puntare obiettivi sempre più ambiziosi.

Uno degli obiettivi più ambiziosi all’interno delle malattie genetiche è sicuramente il cancro. Esso origina da mutazioni nel DNA che causano una crescita incontrollata delle cellule, le quali possono poi addirittura staccarsi dal loro tessuto d’origine e andare in altre parti del nostro corpo, formando quelle che conosciamo col nome di metastasi. A differenza delle patologie citate prima, il cancro non è caratterizzato da una singola mutazione, ma da molteplici, quindi correggerne una non sarebbe sufficiente ad assicurare la remissione. La facilità di utilizzo e la flessibilità di CRISPR/Cas permette di affrontare il problema da due angolazioni diverse: trattare il paziente direttamente e correggere i vari geni difettosi contemporaneamente, oppure modificare alcuni tipi di cellule del sistema immunitario del paziente in laboratorio per “addestrarle” a riconoscere le cellule tumorali e distruggerle (terapia CAR-T). Se il primo approccio è estremamente ambizioso e al momento prettamente teorico, il secondo è un qualcosa di già approvato per certi tipi di linfoma e che, non solo è reso possibile da CRISPR/Cas (o quantomeno facilitato), ma le cui limitazioni potrebbero essere risolte con un ulteriore utilizzo di questa tecnologia. Infatti, se le cellule prese dal paziente non dovessero essere sufficienti, o presentassero dei problemi, si potrebbero usare cellule prelevate da donatori sani e ingegnerizzarle sia per riconoscere il tumore e sia per eliminare quelle componenti che andrebbero a dare rigetto nel paziente, un limite che al momento complica appunto l’utilizzo di cellule da donatori.

La strada per arrivare a terapie efficaci e accessibili è indubbiamente ancora lunga e tortuosa, ma grazie a CRISPR/Cas e alla rivoluzione dell’editing genomico e della terapia genica, ora sappiamo che abbiamo i mezzi per percorrerla e per raggiungere quei risultati che fino a pochi anni fa ci sembravano impossibili.

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